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免疫组化染色手艺中常见问题、缘由剖析及解决方案

公布工夫:2013-3-18 14:26:16

常见问题 缘由剖析 解决方案
染色阴性 阳性对比染色建立,受测构造染色阴性。 受测构造中没有受测抗原。 按染色阴性效果处置惩罚,无需反复实行。
阳性对比染色不建立,受测构造染色阴性。 抗原修复操纵欠妥。如:①发起无需抗原修复,实际操作却停止抗原热修复(如迈新编号RAB-0090,HBcAg);②发起停止抗原酶消化修复,实际操作却停止抗原热修复或不修复(如迈新编号MAB-0280,MOC31)。 根据一抗说明书中发起的抗原修复体式格局,停止准确的抗原修复操纵。
一抗取二抗检测体系种属婚配性毛病。 凭据一抗的种属准确挑选婚配性的二抗检测体系。如受测构造为人体标本时,一抗为鼠抗,则二抗检测体系挑选抗鼠或抗鼠/兔;一抗为兔抗,则二抗检测体系挑选抗兔或抗鼠/兔。
实行操纵中泛起毛病。如漏加某一试剂或试剂滴加递次毛病。 严厉根据试剂说明书中发起的实行要领停止实行。
关于稀释试剂而言,能够运用了不合格的稀释剂。一抗稀释剂偏酸时,会影响一抗取抗原的联合才能;二抗检测体系稀释剂中若含有叠氮钠等防腐剂时会影响二抗检测体系取一抗的联合才能。 运用及格的稀释试剂稀释剂。
一抗挑选毛病,选用了只能用于冰冻构造而不克不及用于白腊包埋构造的一抗。 挑选能用于白腊包埋构造的一抗。
一抗、二抗检测体系、显色试剂被净化,生效或已凌驾有效期。 运用无污染,正在有效期内且机能优越的试剂停止实行。
二抗检测体系取显色试剂不婚配。 凭据二抗检测体系的品种,挑选响应的显色试剂。如辣根过氧化物酶二抗检测体系可选择DAB、AEC显色试剂;碱性磷酸酶二抗检测体系可选择BCIP/NBT、AP/Red显色试剂等。
抗原含量过低。 运用放大效应更高的二抗检测体系停止实行。
试剂浓度过低、过高或不合适的孵育工夫和温度。 挑选浓度适宜的试剂,根据说明书中发起的孵育体式格局停止实行。
水溶性色本显色后运用了露醇的复染液或用乙醇脱水、二甲苯通明(如AEC、BCIP/NBT、AP-Red等显色试剂)。 从新染色,并运用水溶性的复染液和启片剂。
染色强 阳性对比染色建立,受测构造染色强。 流动液运用欠妥,损坏了标本构造中的抗原。 检察一抗说明书或相干文献,运用推荐的流动液(如10%中性缓冲福尔马林流动液等)。
构造经流动和包埋等处置惩罚后抗原被损坏。 新颖构造实时流动,防备其自溶;挑选适宜的流动液,流动工夫应相符要求;运用低熔点的硬蜡(58℃阁下)包埋,包埋温度不超过60℃。
烤片温度过高或工夫过长。 烤片温度以高于用于包埋的白腊熔点3-5℃(或65-70℃)为适,烤片工夫为1-2h。
受测构造中抗原含量低。 运用放大效应更高的二抗检测体系停止实行。
阳性对比和受测构造均为染色强。 抗原修复体式格局不正确或漏掉。如修复工夫、温度,修复液的pH值没有到达要求或要求停止抗原修复的却没有停止抗原修复等。 根据一抗说明书中发起的抗原修复体式格局停止抗原修复。修复历程要准确:修复温度,工夫要到达要求,修复液挑选适当。
过氧化物酶阻断试剂阻断或血清关闭工夫过长,试剂浓度不合适。 运用市卖的即用型试剂并根据说明书中发起的孵育体式格局停止实行。
一抗、二抗检测体系、显色试剂浓度过高、过低或孵育工夫过短。 调解试剂浓度或运用市售即用型试剂并根据说明书中发起的孵育体式格局停止实行。
运用已凌驾有效期的试剂。 运用有效期内机能优越的试剂停止实行。
孵育温度太低(低于15℃)。 延伸孵育工夫;或正在37℃温箱内孵育,但应收缩孵育工夫(30min)。
滴加试剂时,组织上的缓冲液(或血清)残留过多,致使试剂滴加后被稀释。 每次滴加试剂前将组织上的缓冲液(或血清)撤除,但应防备构造枯燥。
复染液复染过分。 复染时以细胞核浓染为适(不同类型苏木素配方差别,染色工夫也不同,需优化染色工夫)。
重复使用抗原修复液(能够致使修复液的pH值发作改动或混合杂质,进而影响抗原修复结果)。 每次运用新颖配制的抗原修复液,并将其pH值调解至要求范围内。
显色试剂孵育工夫过短或试剂配制毛病(如配制DAB时,过氧化氢浓度不适或色本的量增加过量等)。 配制显色试剂时严厉根据说明书中发起的使用方法实行;前提许可的话最幸亏显微镜下视察掌握显色工夫。
阳性对比染色建立,受测构造泛起“阴阳脸”着色。 滴加试剂时,试剂未完齐掩盖构造。 每次滴加试剂后,细致搜检一遍,确保试剂将构造完整掩盖。
实行操纵台面不屈或孵育盒不屈,致使切片有个倾斜度,试剂滴加后将流向水平面低的一边,形成另一边的构造已被试剂掩盖或试剂很少,致使终究染色成“阴阳脸”效果。 实行时确保实行台面和孵育盒是程度的。
滴加试剂到组织上时存在气泡,却没有将气泡撤除。 滴加试剂后再细致搜检一遍,若发现有气泡存在,务必将气泡撤除。
构造流动工夫过短,形成构造中央部位流动缺乏。 构造流动工夫应到达尺度要求。
配景染色 对比构造和受测构造,或正在一些构造身分如脂肪、结缔组织和上皮组织中有配景染色。 切片脱蜡不完全。 运用新颖的二甲苯或其替代品停止脱蜡。
抗原修复过分。 严格控制抗原修复工夫,温度;根据一抗说明书中发起的抗原修复体式格局实行或探索出更合适本身实验室的抗原修复体式格局。
一抗浓度过高、孵育工夫过长或孵育温度过高。 低落一抗浓度,收缩孵育工夫,掌握孵育温度。一抗孵育情况一样平常为:室温1h、4℃留宿或37℃30min(可凭据实验室本身状况做响应调解)。
二抗检测体系浓度过高、孵育工夫过长或孵育温度过高。 低落试剂浓度,根据试剂说明书中发起的孵育体式格局停止实行。
显色试剂孵育工夫过长。 收缩显色试剂孵育工夫,最好能正在显微镜下视察掌握显色工夫。
PBS缓冲液重复使用屡次或玻片冲刷缺乏。 每次运用新颖的PBS缓冲液,玻片冲刷一定要充裕,可正在缓冲液中增加0.025-0.05%的Tween-20。
运用毛病的关闭血清。 关闭血清一样平常取二抗检测体系种属雷同,大概运用无血清卵白关闭,然则不克不及挑选取一抗种属雷同的血清。
载玻片中粘附剂过薄。 从新配制粘附剂,建造新的防脱玻片。
受测构造和阴性试剂对比泛起配景染色,而阳性和阴性构造对比染色建立。 构造流动不实时,形成局部抗原弥散并遗留正在构造内。 构造实时流动。
取材时,因为运用钝的刀片,致使构造遭到工资挤压而变形,血清卵白弥散并遗留正在构造内。 运用厉害的刀片取材。
受测构造有局部坏死、毁伤或榨取身分。 视察染色效果时疏忽此物理性毁伤局部或从新取材。
构造切片太薄。 福尔马林流动、白腊包埋的构造切片厚度一样平常为3-5μm,冰冻切片不超过10μm。
阴性试剂对比不建立,而阳性、阴性构造对比和受测构造染色建立。 阴性对比血清浓度不合适。 运用浓度适宜的阴性对比血清。关于单克隆抗体,阴性对比血清浓度稀释至其Ig含量取一抗邻近;而关于多克隆抗体,则稀释至其卵白含量取一抗邻近。
阴性对比血清被净化并取受测构造中的卵白发作交织回响反映。 运用无污染的阴性对比血清停止实行。
对比染色建立,受测构造泛起灶状配景染色。 裱片时水未排尽,正在部分构成气泡使构造崛起;实行历程中试剂滴加时渗透此地区后不容易冲刷清洁,致使染色过深。 裱片时务势必水排尽。
用于裱片的水浴锅中的水质被细菌或酵母菌等净化。 活期干净水浴锅并包管每次运用清洁的火。
建造APES防脱玻片时,APES的浓度过高,枯燥后正在玻片上留下红色小点,显色时红色小点着色。 严厉根据试剂说明书中发起的使用方法制备防脱玻片。
构造切片有皱褶、扯破、刀痕等,形成实行历程中试剂没有被完全冲刷清洁,进而致使染色过深。 确保受测构造切片完好,不泛起皱褶、扯破、刀痕等。
对比染色建立,受测构造泛起边沿效应。 构造边沿取玻片黏贴不牢,经抗原热修复或后续缓冲液冲刷后,形成边沿构造松脱浮正在玻片上方,每次冲刷时不容易将构造上面的试剂洗净,进而致使此地区染色过深。 构造前期处置惩罚(特别是脱水环节)应范例,切片厚度适中,运用防脱机能优越的玻片,冲刷时不要对着构造冲刷。
滴加试剂时,试剂已充裕掩盖构造,致使构造边沿无试剂或试剂很少,孵育时此地区轻易起首变干,形成浓度较中央构造下而致使染色过深。 每次滴加试剂时务必使试剂充裕掩盖构造(可正在滴加试剂前正在离构造边沿3mm处用免疫组化油笔划圈)。
对比染色建立,受测构造泛起非特异的细胞核着色。 构造前期处置惩罚不适当,如构造正在二甲苯中浸泡工夫过长,流动液运用欠妥;构造变干,抗原修复液的pH值和修复工夫欠妥或修复历程中修复液蒸发过多,形成最初局部构造没有浸泡正在修复液中。 严厉根据尺度操作规程停止操纵。
运用生物素二抗检测体系时,构造中内源性生物素显色。 这类非特同性显色一般发作正在下代谢器官构造中,当构造切片停止抗原热修复后,构造中所露的内源性生物素同生物素二抗检测体系中的链霉菌抗生物素卵白-过氧化物酶发作链接而形成非特同性显色,显色多定位于胞浆中,且疑惑性极大。 运用内源性生物素阻断试剂停止阻断;大概运用非生物素二抗检测体系,如迈新的MaxVisionTM、MaxVisionTM 2、EliVisionTM plus、EliVisionTM Super。
运用辣根过氧化物酶二抗检测体系时,构造中内源性过氧化物酶显色。 这类显色一般发作正在红细胞、坏死构造、炎症细胞中。是因为构造中所露的过氧化物酶没有用响应阻断试剂阻断或阻断不完全。 运用过氧化物酶阻断试剂阻断,恰当延伸阻断工夫;大概运用碱性磷酸酶二抗检测体系。
构造脱片 构造处置惩罚和蜡块挑选欠妥。 根据《临床手艺操纵范例 病理学分册》停止构造处置惩罚,脱水完全,只管不挑选脂肪多的构造。 
载玻片防脱功用差。  运用防脱功用好的载玻片。
抗原修复不正确,如修复过分或修复完毕后敏捷冷却等。  根据一抗说明书中发起的抗原修复体式格局,停止准确的抗原修复操纵。 
构造切片太薄、不均匀、皱褶等。  构造切片厚度为3-5μm,切片完好,匀称,无皱褶等。 
烤片前提:温度过低、工夫过短等。  烤片温度以高于用于包埋的白腊熔点3-5℃(或65-70℃)为适,烤片工夫为1-2h。
冲刷体式格局不正确,如对着构造冲刷。  把握准确的冲刷体式格局。